В настоящее время для диагностики заболеваний человека широко применяются клинико-биохимические методы анализа. Они связаны с определением веществ в биологических жидкостях, главным образом в крови, сыворотке, плазме или моче. К таким методам предъявляются следующие требования: высокая чувствительность, точность, специфичность и высокая скорость реакции. Ферментативные методы, используемые в клинической диагностике, обладают указанными выше свойствами; однако они имеют ряд недостатков, а именно малый срок хранения ферментов в растворе, невозможность использования ферментов в присутствии протеиназ и однократное применение фермента. Инкапсуляция фермента в полиэлектролитные микрокапсулы устраняет эти недостатки. Такие микрокапсулы получают попеременно адсорбируя противоположно заряженные полиэлектролиты на коллоидной частице с последующим ее удалением. Эти микрокапсулы имеют диаметр от 0.5 до 10 мкм и полупроницаемую оболочку, состав и толщину которой можно регулировать.
Ранее Пущинскими учеными под руководством Б.И. Сухорукова и Е.А. Сабуровой впервые было предложено, перед тем как капсулировать какое-либо вещество, изучать его свойства и влияние на него применяемых полимеров.
Сергей Тихоненко, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник ИТЭБ РАН продолжает развивать идеи Сухорукова. Ранее его группой был представлен ряд статей, посвященных изучению влияния полиэлектролитов на уреазу и разработке, на основе полученных данных, диагностической системы для определения мочевины. Дальнейшее развитие данная концепция получила в одной из последних работ, посвященной изучению влияния полиэлектролита на активность алкогольдегидрогеназы, с целью в дальнейшем создать диагностическую систему для определения этанола. Результаты работы опубликованы в журнале Polymers.
В данной статье группа Тихоненко изучила влияние одного из наиболее часто применяемых при создании полиэлектролитных микрокапсул полимеров полиаллиламина на структуру и каталитические характеристики фермента алкогольдегидрогеназы (АДГ). Для этого исследования использовали методы стационарной кинетики и флуоресцентной спектроскопии. «Во время исследования выяснилось, что при воздействии на фермент полиаллиламина его активность падала без изменения его структуры. Поскольку мы предположили, что воздействие полимеров на белок имеет электростатическую природу, мы решили изучить влияние ионной силы на этот эффект. Так, при добавлении соли к АДГ было обнаружено резкое увеличение ее активности. Мы проследили механизм снятия ингибирования в зависимости от вида соли (одно- или двухвалентная), который оказался различным. В случае одновалентных солей происходит электростатическое экранирование фермента от полимера, а в случае двухвалентных активность фермента повышалась без разрушения комплекса АДГ-полимер, что было продемонстрировано методом флуоресценции. Мы сделали вывод, что двухвалентная соль – сульфат - связывается с амино-группами полимера и увеличивают его жесткость, за счет чего освобождается активная петля фермента, с сохранением комплекса с полимером» - сообщил Сергей Тихоненко.
Таким образом, группа Тихоненко выявила два механизма ингибирования фермента и его снятия, а также обнаружила, что нельзя рассматривать воздействие полимеров капсулы на белок как взаимодействие свободного белка с полимером, как было описано в литературе ранее.
Далее на основе полученных данных был закапсулирована АДГ, и впервые было показано, как меняются константы Михаэлиса. Сергей Тихоненко добавил: «Константа Михаэлиса ферментов в свободном состоянии, в комплексе с полиэлектролитом и в микрокапсулах оказались разными. Таким образом, ингибирование фермента в комплексе с полиэлектролитом совершенно другое, чем ингибирование в самой капсуле: в первом случае происходит неконкурентное ингибирование с сохранением четвертичной структуры фермента, а в случае с капсулами идет его иммобилизация. Наша работа показала, что есть существенная разница между супрамолекулярным комплексом и свободным полимером. Эта разница зависит от подвижности самого полиэлектролитного остова ― чем больше степеней свободы у полиэлектролита, тем больше вероятность, что он ингибирует белок. Также были выявлены условия, при которых оптимальнее хранить и использовать капсулы с ферментами ― целесообразно применять двухвалентные соли».
Данная работа выявила механизмы, которые влияют на ухудшение свойств белка в капсулах и предложила условия, при которых это взаимодействие будет минимальным.
Источник: Kim, A.L., Musin, E.V., Dubrovskii, A.V., Tikhonenko, S.A. Effect of pollyallylamine on alcoholdehydrogenase structure and activity. Polymers 12(4),832, 2020.
https://www.mdpi.com/2073-4360/12/4/832
На фото авторский коллектив: сотрудники Лаборатории роста клеток и тканей ИТЭБ РАН Ким А.Л., Мусин Е.В., Тихоненко С.А. и Дубровский А.В.
Материал подготовила: Алсу Дюкина
Пресс-служба ИТЭБ РАН, iteb-press@yandex.ru
Ранее Пущинскими учеными под руководством Б.И. Сухорукова и Е.А. Сабуровой впервые было предложено, перед тем как капсулировать какое-либо вещество, изучать его свойства и влияние на него применяемых полимеров.
Сергей Тихоненко, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник ИТЭБ РАН продолжает развивать идеи Сухорукова. Ранее его группой был представлен ряд статей, посвященных изучению влияния полиэлектролитов на уреазу и разработке, на основе полученных данных, диагностической системы для определения мочевины. Дальнейшее развитие данная концепция получила в одной из последних работ, посвященной изучению влияния полиэлектролита на активность алкогольдегидрогеназы, с целью в дальнейшем создать диагностическую систему для определения этанола. Результаты работы опубликованы в журнале Polymers.
В данной статье группа Тихоненко изучила влияние одного из наиболее часто применяемых при создании полиэлектролитных микрокапсул полимеров полиаллиламина на структуру и каталитические характеристики фермента алкогольдегидрогеназы (АДГ). Для этого исследования использовали методы стационарной кинетики и флуоресцентной спектроскопии. «Во время исследования выяснилось, что при воздействии на фермент полиаллиламина его активность падала без изменения его структуры. Поскольку мы предположили, что воздействие полимеров на белок имеет электростатическую природу, мы решили изучить влияние ионной силы на этот эффект. Так, при добавлении соли к АДГ было обнаружено резкое увеличение ее активности. Мы проследили механизм снятия ингибирования в зависимости от вида соли (одно- или двухвалентная), который оказался различным. В случае одновалентных солей происходит электростатическое экранирование фермента от полимера, а в случае двухвалентных активность фермента повышалась без разрушения комплекса АДГ-полимер, что было продемонстрировано методом флуоресценции. Мы сделали вывод, что двухвалентная соль – сульфат - связывается с амино-группами полимера и увеличивают его жесткость, за счет чего освобождается активная петля фермента, с сохранением комплекса с полимером» - сообщил Сергей Тихоненко.
Таким образом, группа Тихоненко выявила два механизма ингибирования фермента и его снятия, а также обнаружила, что нельзя рассматривать воздействие полимеров капсулы на белок как взаимодействие свободного белка с полимером, как было описано в литературе ранее.
Далее на основе полученных данных был закапсулирована АДГ, и впервые было показано, как меняются константы Михаэлиса. Сергей Тихоненко добавил: «Константа Михаэлиса ферментов в свободном состоянии, в комплексе с полиэлектролитом и в микрокапсулах оказались разными. Таким образом, ингибирование фермента в комплексе с полиэлектролитом совершенно другое, чем ингибирование в самой капсуле: в первом случае происходит неконкурентное ингибирование с сохранением четвертичной структуры фермента, а в случае с капсулами идет его иммобилизация. Наша работа показала, что есть существенная разница между супрамолекулярным комплексом и свободным полимером. Эта разница зависит от подвижности самого полиэлектролитного остова ― чем больше степеней свободы у полиэлектролита, тем больше вероятность, что он ингибирует белок. Также были выявлены условия, при которых оптимальнее хранить и использовать капсулы с ферментами ― целесообразно применять двухвалентные соли».
Данная работа выявила механизмы, которые влияют на ухудшение свойств белка в капсулах и предложила условия, при которых это взаимодействие будет минимальным.
Источник: Kim, A.L., Musin, E.V., Dubrovskii, A.V., Tikhonenko, S.A. Effect of pollyallylamine on alcoholdehydrogenase structure and activity. Polymers 12(4),832, 2020.
https://www.mdpi.com/2073-4360/12/4/832
На фото авторский коллектив: сотрудники Лаборатории роста клеток и тканей ИТЭБ РАН Ким А.Л., Мусин Е.В., Тихоненко С.А. и Дубровский А.В.
Материал подготовила: Алсу Дюкина
Пресс-служба ИТЭБ РАН, iteb-press@yandex.ru
