Ученые из различных институтов Пущино исследовали, как фермент бактериофага Т5 действует на кишечную палочку. Они показали, что фермент в присутствии антисептиков активно губит болезнетворные бактерии даже в неблагоприятных условиях. Эта работа, опубликованная в недавнем выпуске Journal of Applied Microbiology, направлена на поиск лечения инфекций без помощи антибиотиков.
Проблема лечения бактериальных инфекций антибиотиками уже много лет беспокоит врачей. За более чем полвека, что мы принимаем антибиотики, микробы к ним привыкли, выработали устойчивые штаммы и в некоторых случаях перестали реагировать на лечение. Причем особо устойчивые штаммы бактерий могут сопротивляться широкому спектру антибиотиков. Учитывая все это, а также что новые антибиотики открывают все реже, важно найти другие способы борьбы с инфекцией. Особенно сложно лечить стойкие внутрибольничные инфекции, вызываемые грамотрицательными патогенами родов Pseudomonas, Acinetobacter, Salmonella, Klebsiella, Proteus, Escherichia, Aeromonas, Yersinia, Campylobacter. С действием этих инфекций знакомы многие пациенты хирургических отделений и роддомов. Вызываемые ими воспаления протекают тяжело и нередко приводят к смерти.
Ученые из филиала Института биоорганической химии имени академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН и Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН изучают бактериофагов в качестве средства против грамотрицательных бактерий. Бактериофаги — это вирусы, которые убивают бактериальные клетки. В России давно и успешно изучают бактериофагов. Но ученые из Пущино работают не с самими бактериофагами, а с их белками-ферментами - эндолизинами.
— Эти ферменты разрушают основной компонент клеточной стенки бактерий — пептидогликан, после чего «незащищенная» бактериальная клетка погибает в результате осмотического лизиса, то есть растворения, — пояснила руководитель работы Галина Микулинская из отдела биоинженерии ФИБХ РАН.
Эти фаговые ферменты очень активны, вызывают слабый иммунный ответ, и вряд ли микробы выработают на них устойчивые штаммы. Из них делают препараты, но только против грамположительных возбудителей. А у грамотрицательных бактерий есть наружная мембрана, через которую эндолизины не могут проникнуть. Ученые всего мира пытаются решить эту проблему.
В Пущино решили изучить действие эндолизина бактериофага Т5 в сочетании с агентами, которые увеличивают проницаемость мембраны клетки. В результате экспериментов на культурах клеток кишечной палочки ученые определили, что вместе фермент и агент уничтожают бактерии намного эффективнее, чем каждый по отдельности. Им удалось уменьшить количество выживших клеток на 4-6 порядков относительно контрольного опыта.
В качестве агента ученые взяли дешевые, распространенные антисептики, такие как хлоргексидин, причем в очень низких концентрациях. Важно, что фермент сохранял активность даже после получасового нагревания до 90 градусов Цельсия.
Высокую устойчивость к нагреванию для этого белка подтвердили спектральные исследования, которые провел Николай Молочков, сотрудник Лаборатории исследований биосистем с помощью ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) ИТЭБ РАН.
— Нами были сняты спектры эндолизина при различных температурах, пошагово от 20 до 95 градусов Цельсия, — рассказывает Николай. — Если подвергнуть белок нагреванию, он теряет свою вторичную структуру, т.е. происходит его денатурация. Однако, при возвращении белка от высоких температур к 20 градусам, на 70-80% его структура восстанавливается. Это согласуется с данными моих коллег из ФИБХ, согласно которым эндолизин после нагрева сохраняет 60-70% активности.
Устойчивость фермента к нагреванию — полезное свойство, если в будущем дойдет дело до разработки фармпрепарата. культура бактерий, с которой работали ученые, максимально повторяла условия реальной инфекции.
Это исследование — часть фундаментальной работы, цель которой понять, как работает эндолизин бактериофага Т5 и другие эндолизины, какая у них активность и регуляция, какова пространственная структура. На следующем этапе авторы работы планируют взять другие штаммы бактерий, например, псевдомонады или клебсиеллы, и посмотреть, как эндолизины будут действовать на них.
Работа поддержана РФФИ, гранты № 14-44-03573, 13-04-00991.
Фото Андрея Мачулина.
Клетки кишечной палочки до и после воздействия коктейлем фермента с агентом. Снимки сделаны с помощью фазово-контрастной микроскопии.
Материал подготовили: Татьяна Пичугина, Татьяна Перевязова
Источник: Shavrina MS, Zimin AA, Molochkov NV, Chernyshov SV, Machulin AV, Mikoulinskaia GV. In vitro study of the antibacterial effect of the bacteriophage T5 thermostable endolysin on Escherichia coli cells. J Appl Microbiol. 2016 Nov;121(5):1282-1290. doi: 10.1111/jam.13251. Epub 2016 Sep 19.
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jam.13251/abstract;jsessionid=08248F032851182BE4A18EDDA739F54F.f03t04
Галерея
