Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Институт теоретической и экспериментальной биофизики
Российской академии наук
en ИТЭБ (ru)
Российские учёные разработали новый метод быстрого отбора клеток с генными модификациями с помощью CRISPR/Cas9

Настоящую революцию в генной инженерии произвело открытие системы CRISPR/Cas9. CRISPR – это короткие повторяющиеся участки в ДНК (дословно «сгруппированные короткие палиндромные повторы»), которые вместе с белками Cas (дословно «белки, связанные с CRISPR») представляют собой своеобразный аналог иммунитета у бактерий, они помогают микроорганизмам защищаться от вирусов. CRISPR хранят в себе информацию о вирусах, ранее атаковавших бактерии, а Cas разрезают вирусную ДНК для дальнейшего уничтожения. С 2013 года мировое научное сообщество начало применять эту систему для редактирования генов не только бактерий, но и высших организмов (активно проводятся первые эксперименты на клетках человека), что открывает новые возможности для лечения всевозможных болезней человека, включая тяжелейшие вирусные, онкологические и наследственные (например, ВИЧ, синдром Дауна и др.)

Российские ученые из 6 крупных научных организаций г. Москвы и г. Пущино совместно разработали новую стратегию получения клеточных нокаутов, которая избавляет от долгой и кропотливой процедуры выращивания и скрининга клонов в целях поиска желаемой мутации. С результатами этого крупного исследования подробнее можно ознакомиться в февральском номере журнала Scientific Reports, публикуемого издательством Nature Research.

Основной разработчик данного подхода, Мазуров Дмитрий Вячеславович, кандидат медицинских наук, руководитель группы клеточных и генных технологий Института биологии гена РАН поделился с пресс-службой ИТЭБ РАН основной идеей метода «Разработанный нами новый метод отбора редактированных клеток заключается в том, что клетки с искомой генной модификацией экспонируют на своей поверхности короткий пептид. С помощью антитела к данному пептиду и, используя метод клеточной сортировки, можно легко и быстро выделить желаемые клетки-нокауты по любым генам, в том числе продукты которых находятся внутри клетки или секретируются во внешнюю среду. Генетическая конструкция, которую мы разработали, и которая позволяет пептиду транспортироваться на поверхность клетки и одновременно выключать ген, является самой короткой, но в тоже время эффективной среди существующих в настоящее время маркеров селекции. Мы назвали наш метод SORTS (surface oligopeptide knock-in for rapid target selection), аббревиатура которого в переводе близка к слову «сортировка» и отражает суть нового метода. SORTS оказался полезным не только для необратимой инактивации гена, но и для регулируемого с помощью так называемого дегрона выключения гена на уровне белка, что позволяет изучать функцию жизненно-важных генов».

Соавтор данной работы, Холмухамедов Эхсон Лукманович, доктор биологических наук, главный научный сотрудник лаборатории фармакологической регуляции клеточной резистентности Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, подтвердил новизну и экспериментальные преимущества нового подхода: «Разработанный метод обеспечивает быстрый и эффективный отбор полученных нокаутов без длительного и трудоемкого метода клонирования клеток, что позволило нам быстро и надежно получить три линии генетически отредактированных клеток эмбриональных почек человека, нокаутных по содержанию митохондриальных поринов». Применение этого метода, по утверждению авторов «подходит для любых генов, а также может иметь дополнительные преимущества по сравнению с уже имеющимися методами молекулярной биологии». На примере клеточных культур человека, зараженных ВИЧ, авторский коллектив уже продемонстрировал возможность уничтожения данного вируса, ДНК которого стабильно встраивается в геном человека и не может быть удалена современными средствами лечения. Работа в этом направлении продолжается.

Исследование поддержано грантами 18-14-00333, 17-14-01107 Российского научного фонда, программой фундаментальных научных исследований государственных академий на 2013-2020 годы, грантами 18-29-07052, 18-04-01016 и 18-34-00712 от Российского фонда фундаментальных исследований, а также проектом 14.Z50. 31.

Источники:
A. Zotova, A. Pichugin, A. Atemasova, E. Knyazhanskaya, E. Lopatukhina, N. Mitkin, E. Holmuhamedov, M. Gottikh, D. Kuprash, A. Filatov & D. Mazurov Isolation of gene-edited cells via knock-in of short glycophosphatidylinositol-anchored epitope tags // Scientific Reports, 2019, V.9, N 3132.
https://www.nature.com/articles/s41598-019-40219-z

Материал подготовила:
Полина Кирсанова
Пресс-служба ИТЭБ РАН, iteb-press@yandex.ru