Ученые ИТЭБ РАН предложили измерять активность ДНК-полимераз по-новому

Пущинские ученые разработали экспресс-метод для измерения активности ДНКполимераз. ДНК-полимераза — это фермент, который синтезирует ДНК из «строительных блоков» - дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (дНТФ), используя в качестве шаблона родительскую цепь.

Благодаря уникальным свойствам ДНК-полимеразы активно применяют в науке и медицине. Например, реакция ПЦР - самый быстрый и точный способ постановки диагноза множества инфекционных заболеваний, невозможна без полимеразы. Важная характеристика любой полимеразы - активность. К настоящему моменту существуют несколько методик, позволяющих измерять этот параметр. Почти все они основаны на подсчёте дНТФ, которые полимераза за определенный отрезок времени способна соединить друг с другом на матрице одноцепочечной ДНК. Чтобы осуществить этот подсчет, дНТФ метят либо флуоресцентной, либо радиоактивной меткой. Одна из стратегий для дальнейшего исследования — осаждение ДНК на стекловолокне, нитроцеллюлозе или хроматографической бумаге. Для каждой пробы с измерением активности, из одного из вышеперечисленных материалов вырезают индивидуальный диск, который необходимо каким-то образом пометить. Затем на диски наносятся пробы. Во избежание перекрестного загрязнения, часть последующих манипуляций необходимо проводить в отдельных пробирках, и с использованием дорогостоящей установки. Итого на инкубацию, промывки и высушивание дисков затрачивается около часа.

Сотрудницы ИТЭБ РАН Надежда Зырина и Валерия Антипова модифицировали описанный выше метод кислотной преципитации ДНК для измерения активности ДНКполимеразы. Они предложили использовать вместо индивидуальных дисков тест-полоски, длиной 20-24 см и шириной 2,5 см, выполненные из GF/C стекловолокна. Этот материал выбрали за его большую прочность и в то же время эластичность. На этой полоске вырезают зубцы, на которые впоследствии наносят пробы фермента. Один из углов тестполоски обрезают, чтобы не помечать каждую индивидуальную пробу - можно просто записать отдельно порядок нанесения проб относительно отрезанного уголка. При этом устраняется опасность того, что при промывках с фильтра сотрется отметка. Обработку всех проб на тестполоске можно проводить одновременно, в одном химическом стакане, без специального оборудования, необходимого при использовании классического метода, описанного выше. Итого, на обработку 12 проб затрачивается около 12-15 минут.

Еще одним несомненный плюс этого метода - поскольку меньше реактивов расходуется на работу с радиоактивно мечеными образцами, после опыта нужно утилизировать меньшее количество радиоактивных отходов. Экономия времени и реактивов, а также уменьшение объема утилизируемых отходов, позволяют значительно уменьшить стоимость каждого эксперимента.

- Особенно удобно использовать подобные тест-полоски, если нужно работать с большим количеством проб, - рассказывает один из авторов этой работы, научный сотрудник лаборатории рентгеноструктурного анализа Надежда Зырина, - данный метод разработан для скрининга большого количества образцов, которые, как правило, представляют собой, либо лизаты микроорганизмов, либо фракции с колоночной хроматографии. В то же время, при работе с ДНК-полимеразой мы остаемся в рамках стандартной методики оценки полимеразной активности на основе осаждения кислотонерастворимого полимера, принятой в практике крупнейших фирмпроизводителей ДНК-полимераз.

Авторы проверили эффективность метода на Bst-полимеразе, приобретенной на фирме New Englang Biolabs. Разница в измерениях активности этой полимеразы классическим методом и экспресс-методом с использованием тест-полоски оказалась в пределах погрешности. Можно сказать, что экспресс-метод измерения полимеразной активности имеет значительные преимущества перед традиционными методами: поскольку отпадает необходимость в дорогостоящей установке, метод становится более доступным для исследователей, а также позволяет им экономить время и деньги. Авторы работы полагают, что их новация несомненно вызовет интерес широкого круга ученых.

Подготовила: Татьяна Перевязова (iteb-press@yandex.ru)

Фото: пресс-служба ИТЭБ-РАН

Источник: Kordyukova MY, Antipova VN, Rogachevsky VV, Zyrina NV. An acid precipitation technique: A strip assay for the large-scale DNA polymerase activity screening. Журнал Anal Biochem. 2016 Nov 15;513:39-42.
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003269716302603