Ученые из Пущино выяснили, как влияет полигистидиновый «хвост» на активность и свойства эндолизина бактериофага Т5

Ученые из Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН совместно с коллегами из Филиала Института биоорганической химии РАН и Института приборостроения РАН исследовали, каким образом влияет на активность и физико-химические свойства рекомбинантных белков добавление к их первичной структуре «хвостов» из нескольких остатков аминокислоты гистидина. Результаты своих исследований они изложили в мартовском выпуске журнала International Journal of Biological Macromolecules.

Добавление полигистидинового «хвоста» к одному из концов рекомбинантного белка представляет собой одну из наиболее распространенных генетических модификаций рекомбинантных белков и широко используется исследователями. Наличие этой модификации позволяет существенно упростить выделение и очистку целевого белка, зачастую сводя его к одностадийной хроматографии на сорбенте, содержащей ионы никеля, кобальта или меди. Целевой белок, обладающий таким «хвостом», удерживается на металлосодержащем сорбенте, в отличие от всех остальных клеточных белков, не имеющих такого «хвоста». Затем связавшийся белок смывают с сорбента с помощью буфера, содержащего имидазол.

Но у исследователей, работающих с подобными белками, возникает вопрос: не влияет ли такая модификация на структуру и функцию конкретного белка. К настоящему времени подобных исследований проводилось крайне мало.

Ученые из Лаборатории ЯМР-исследований биосистем ИТЭБ РАН проанализировали влияние добавления полигистидинового «хвоста» на ферментативную активность и структуру хорошо изученного белка эндолизина бактериофага Т5. Применение этого белка для биотехнологии и медицины представляется очень перспективным: исследователи уже продемонстрировали его способность в присутствии антисептиков активно уничтожать болезнетворные бактерии, и в будущем, вполне вероятно, эндолизин бактериофага Т5 может стать средством, альтернативным антибиотикам. Поэтому оптимизация условий очистки такого белка, как и последствия такой оптимизации, несомненно, представляют большой интерес.
Помимо сугубо практического интереса именно этот белок привлек внимание ученых в качестве модели еще по нескольким причинам. «Во-первых, эндолизин является ферментом, и ферментативную активность и функциональные свойства рекомбинантного белка с гистидиновым «хвостом» можно измерить и сравнить с достаточной степенью достоверности с свойствами белка без “хвоста”. Во-вторых, это небольшой белок (его длина 137 аминокислотных остатков), структура которого в растворе может быть проанализирована с помощью ЯМР (ядерного магнитного резонанса) высокого разрешения», - рассказал заведующий Лабораторией ЯМР-исследований биосистем ИТЭБ РАН, доктор физико-математических наук Виктор Павлович Кутышенко. Кроме того, интересным моментом в этом исследовании был тот факт, что активный центр эндолизина бактериофага Т5 расположен вблизи С-конца полипептидной цепи этого белка, где ученые расположили и полигистидиновый «хвост». Не повлияет ли подобное близкое соседство «хвоста» и активного центра на сворачивание полипептидной цепи?

Оказалось, что сам по себе гистидиновый «хвост» не оказывает значительного влияния ни на активность, ни на фолдинг белка. Не меняется и связывание ионов цинка и кальция с белком. Тем не менее ученые выяснили, что эндолизин с гистидиновым «хвостом» хранится без потери ферментативной активности меньше, чем фермент без «хвоста». Как предполагают исследователи, это связано с тем, что рекомбинантный белок, несущий полигистидиновый «хвост», склонен к самоассоциации. Также оказалось, что изменилась термостабильность белка: она снизилась на 100С. Помимо всего вышесказанного, негативное влияние на активность фермента оказывает присутствие имидазола и ионов никеля, которые появляются в белковом растворе во время хроматографической очистки. Активность белка может быть восстановлена путем тщательного вымывания этих низкомолекулярных примесей с помощью длительного диализа целевого белка в специально подобранных условиях.

Авторы работы отмечают, что данные, полученные для конкретного белка - эндолизина бактериофага Т5, нельзя догматически проецировать на другие белки. Тем не менее их выводы помогут исследователям, планирующим работу с рекомбинантными белками, выбрать правильную стратегию для выполнения своих задач.



Источники:
Victor P.Kutyshenko, Galina V.Mikoulinskaia, Sergei V.Chernyshov, Alexander Y.Yegorov, Dmitry A.Prokhorov,Vladimir N.Uversky. Effect of C-terminal His-tag and purification routine on the activity and structure of the metalloenzyme, L-alanyl-D-glutamate peptidase of the bacteriophage T5. International Journal of Biological Macromolecules, Volume 124, 1 March 2019, Pages 810-818
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S014181301835219X



Материал подготовила:
Татьяна Перевязова
Пресс-служба ИТЭБ РАН, iteb-press@yandex.ru